biotin-TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒

貨號：B0068

存儲條件：本產(chǎn)品應(yīng)置于-20℃儲存，組分 A、E、G 需避光，避免反復(fù)凍融。有效期見外包裝。

注：組分 A、E、F、G 使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。

產(chǎn)品組分：

產(chǎn)品簡介：

細(xì)胞凋亡的一個顯著特點是細(xì)胞染色體DNA 的降解， 這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的DNA片段約為 180bp-200bp的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，本試劑盒采用TUNEL法，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3′-OH末端催化摻入生wu素（Biotin）標(biāo)記的dUTP (Biotin-X-dUTP)。隨后和辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的Streptavidin(Streptavidin-HRP) 特異結(jié)合， 最后在 HRP 的催化下通過DAB 顯色來顯示凋亡細(xì)胞，從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡觀察并計數(shù)凋亡細(xì)胞。由于正常的或正在增值的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有 3′-OH 形成，很少能被染色。TUNEL法可以選擇性的對凋亡細(xì)胞直接進(jìn)行原位檢測，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細(xì)胞，是一種更快速、直接的檢測手段。

使用方法：

實驗材料（自備）

PBS 緩沖液（pH~7.4）

4%多聚jia醛（PBS 配制）

PBS 配制 0.3% H2O2（新鮮配制）

70%乙醇（自選）

脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）

注意事項：

1. 熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。

2. 在使用DAPI熒光封片劑的情況下，雖然可減緩淬滅，仍需盡量避光。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

實驗步驟

1.樣本準(zhǔn)備：

（1）細(xì)胞樣品

a. 可選：準(zhǔn)備一份陰性對照樣本（加入不含TdT酶的TUNEL反應(yīng)液）。

b. PBS 清洗細(xì)胞兩次。

c. 細(xì)胞固定：加入適量4%多聚jia醛（pH 7.4）溶液，4℃放置30min。

d. PBS清洗細(xì)胞兩次。

e. 通透細(xì)胞：細(xì)胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置 20 min。

f. PBS清洗細(xì)胞兩次。

g.封閉細(xì)胞：每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3% H2O2溶液，輕敲孔板使其充分覆蓋細(xì)胞，室溫避光封閉30min，用 1×PBS 清洗細(xì)胞 2 次；

（2）石蠟組織切片

a.室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min， 以徹di脫掉石蠟。

注：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風(fēng)櫥中進(jìn)行此操作。

b.室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次，每次5 min。

c.室溫下，將切片樣本連續(xù)浸沒在不同濃度梯度的乙醇

（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗1次，每次5 min。

d.室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗3 min，再將切片浸沒于1×PBS中漂洗3 min，用濾紙小心吸干切片樣本周圍液體。

e.用免疫組化筆圍描繪樣品輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。

f.按1: 100的比例，將2mg/mL的蛋白酶K溶液用1×PBS稀釋至終濃度20µg/mL，在每個樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育20min（蛋白酶K的孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化）。

注：蛋白酶K可以幫助滲透組織，時間短達(dá)不到通透效果， 但延長孵育時間可能導(dǎo)致切片脫落。一般情況下，厚度4µm孵育10min，厚度30µm孵育30min。

g.PBS浸潤清洗切片兩次，每次5min。

h.封閉：加入適量配制于PBS中的0.3% H2O2溶液（新鮮配制），室溫孵育30 min，以滅活切片內(nèi)源的過氧化氫酶。

i.PBS浸潤清洗切片兩次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。

（3）冰凍組織切片

a.將冰凍切片放置于室溫的片架上，室溫20 min，晾干。

b.將載玻片浸沒在4%多聚jia醛溶液中，室溫固定30 min。

c.PBS浸潤清洗切片兩次，每次5 min。

d.用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。

e.按1:100的比例，將2 mg/mL 的蛋白酶K溶液用1×PBS 稀釋至終濃度20 µg/mL。每個樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育10min（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化）。

注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織，時間短達(dá)不到通透效果， 但延長孵育時間可能導(dǎo)致切片脫落。一般情況下，厚度4 µm孵育10 min，厚度30 µm 孵育30 min。

f.PBS 浸潤清洗切片兩次，每次 5 min。

g.封閉：加入適量配制于PBS中的0.3% H2O2 溶液（新鮮配制），室溫孵育30 min，以滅活切片內(nèi)源的過氧化氫酶。

h.PBS清洗樣品3次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。

（4）陽性處理（僅陽性對照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行TUNEL反應(yīng)步驟）

a.按1:10的比例用 ddH2O 將10×DNase I Buffer 稀釋成1×DNase I Buffer 備用。

b.滴加100 µL 1×DNase I Buffer 到已通透的樣本上，室溫平衡5 min。

c.用1×DNase I Buffer以1:100稀釋DNase I (2 U/μL)，使其為終濃度20 U/mL 的工作液。

d.輕輕吸掉多余液體，加入100μL濃度為20 U/mL DNase I工作液，室溫孵育10min。

e.輕輕吸掉多余液體，PBS 清洗樣品2次。

2.TUNEL 反應(yīng)

（1）配制TUNEL 反應(yīng)液（即用即配）：

（2）每個樣本加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)液，使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃孵育 60 min。

注：50μL TUNEL 反應(yīng)液適合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以適當(dāng)調(diào)整 TUNEL 反應(yīng)液體積，覆蓋細(xì)胞即可）。

如果待檢測的樣品為涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加 TUNEL 反應(yīng)液后覆蓋在樣本上，可以防止 TUNEL 反應(yīng)液蒸發(fā)，并且使TUNEL 反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。

（3）棄去 TUNEL 反應(yīng)液，PBS 清洗 2 次。

3. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制

（1）Streptavidin-HRP 工作液的配制（即用即配）：

（2）DAB 顯色液的配制（即用即配）：

4. 樣品顯色

（1）向樣品滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，37℃避光 孵育30 min。

注：50 μL Streptavidin-HRP 工作液適合涂片、切片或 96 孔 板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一個孔，如果是 6 孔板， 建議使用 100 μL。為防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸發(fā)，建議在樣品上覆上防蒸發(fā)膜。

（2）PBS清洗樣品3次，每次5min。

（3）向樣品滴加50μL DAB 顯色液，室溫孵育5-30 min或在顯微鏡下根據(jù)顏色的發(fā)展情況掌握染色時間。 注：如果顯色很強(qiáng)可短于 5 min 即停止顯色，如果顯色很弱， 可以適當(dāng)延長顯色時間，甚至顯色過夜。

（4）PBS 清洗樣品3次，每次5 min。

（5）選做：用蘇mu素染色液或甲基綠染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色。隨后用PBS清洗 3 次。

（6）直接光學(xué)顯微鏡下觀察。針對石蠟切片，如果需要封片，使用95%乙醇脫水5 min，再用100%乙醇脫水2次， 每次3min，再用二甲苯透明2次，每次5min。