Annexin V-PE/RedNucleus Ⅱ細胞凋亡試劑盒

貨號：AF2022

儲存條件:4℃避光冷藏，請勿凍存。Annexin V-PE 儲存于 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1% BSA, 0.02% NaN3, pH 7.4 的溶液中。

光譜特性

Annexin V-PE：Ex/Em=488/578 nm RedNucleus II：Ex/Em=635/695 nm

產(chǎn)品介紹

Annexin V 是一類廣泛分布于真核細胞胞漿的鈣離子依賴性的磷脂結合蛋白。Annexin V 則選擇性的結合磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS），PS 在細胞正常狀態(tài)下是分布于細胞磷脂層內(nèi)側，即靠近細胞質，當細胞處于早期凋亡階段，PS 會從細胞內(nèi)側翻轉至細胞外側，此時 Annexin V 可以與 PS 結合，被紅色熒光染料 PE 標記的 Annexin V 作為探針則會在一定波長激發(fā)的情況下檢測出處于早期凋亡狀態(tài)的細胞。對于壞死細胞，由于細胞完整性已經(jīng)被破壞， Annexin V-PE 則可以進入胞漿與處于磷脂層內(nèi)側的 PS 結合，從而也使壞死細胞呈現(xiàn)紅色熒光。

本試劑盒中提供的 RedNucleus II 是一種遠紅光染料， 屬于蒽醌類化合物，不能透過活細胞和早期凋亡細胞完整的細胞膜，是非滲透性的，但是可以快速染色死亡和透化細胞中的細胞核/dsDNA。RedNucleus II 是一種理想的碘化丙啶( PI )和7-AAD的替代物，與 PE聯(lián)用，無需補償調節(jié)，具有更好的光譜特性：不受紫外線的激發(fā)，也不與 PE/PE 同系物重疊發(fā)射，故可以和 FITC，PE 及紫色熒光染料結合用于多色分析。與 Annexin V-PE 聯(lián)用時，RedNucleus II 被排除在活細胞和早期凋亡細胞外，而晚期凋亡細胞和死細胞則同時被 Annexin V-PE 和 RedNucleus II 結合染色呈現(xiàn)雙陽性。

Annexin V-PE/RedNucleus II 細胞凋亡檢測試劑盒可用流式細胞儀及或其他熒光檢測設備進行檢測。

使用方法

1. 根據(jù)實驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經(jīng)處理的細胞樣品，作為陰性對照。

2. 沉淀細胞：對于懸浮細胞：1000 rpm，離心 5 min。對于貼壁細胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后 1000 rpm，離心 5 min。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。對于特定的細胞，如果細胞無法*離心至管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50 μL 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。

注：用胰蛋白酶消化然后使細胞在最hao細胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復約 30 min，然后再染色。胰蛋白酶消化會暫時破壞質膜，允許 Annexin V 結合磷脂酰絲氨酸在細胞膜的細胞質表面上，從而導致假陽性染色。

3. 加入約 1 mL 4℃預冷的 PBS，重懸細胞，1000 rpm，離心 5 min。

4. 重復步驟 3。

5. 用 1×Annexin V 結合緩沖液重懸細胞，調節(jié)其濃度為1-5×106 細胞/mL。  

6.取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中， 加入5 μL Annexin V-PE、5 μL RedNucleus II，混勻后于室溫避光孵育15-20 min。

7.（可選步驟）準備兩管額外的凋亡細胞，每管中只加入一種單染染料（Annexin V-PE 或 RedNucleus II），用于流式單染的補償調節(jié)）。

8. 加入 400 μL 1× Annexin V 結合緩沖液，混勻，進行流式檢測，Annexin V-PE 由 488 nm 激光激發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜在 578 nm 處（FL2 或 BL2 通道），RedNucleus II 由 638 nm激發(fā)，選擇 FL4 或RL1 通道檢測。

注意事項

1.熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的 Tip 頭吸液。

3.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。